MALDI-TOF мас-спектрометрія: революційний метод ідентифікації мікроорганізмів

MALDI-TOF мас-спектрометрія: революційний метод ідентифікації мікроорганізмів у клінічній мікробіології

Вступ

Мас-спектрометрія з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією та часопролітним аналізатором (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) за останнє десятиліття здійснила революцію в клінічній мікробіології, змінивши підхід до ідентифікації патогенних мікроорганізмів. Ця технологія стала стандартом у провідних лабораторіях світу завдяки швидкості, точності та економічній ефективності порівняно з традиційними біохімічними методами.

Принцип роботи MALDI-TOF мас-спектрометрії

Основи методу

MALDI-TOF MS базується на протеомному аналізі конститутивних білкових профілів мікроорганізмів, переважно високоекспресованих рибосомальних білків. Процес ідентифікації включає наступні етапи:

1. Підготовка зразка: невелика кількість мікробної біомаси (достатньо 10²–10⁴ клітин) наноситься на металеву мішень-пластину та змішується з матрицею (найчастіше α-ціано-4-гідроксикоричною кислотою, CHCA).

2. Іонізація: короткі лазерні імпульси викликають десорбцію та іонізацію білкових молекул. Матриця захищає зразок від фрагментації під час іонізації.

3. Детекція: іонізовані молекули прискорюються електромагнітним полем (~20 кВ) у вакуумній камері. Час польоту (Time of Flight) кожної молекули до детектора залежить від співвідношення маси до заряду (m/z).

4. Ідентифікація: отриманий мас-спектр автоматично порівнюється з еталонною базою даних, що містить понад 2000 видів медично значущих мікроорганізмів. Програмне забезпечення генерує числове значення (score), що відображає ступінь подібності.

Порівняння MALDI-TOF з традиційним бактеріологічним посівом

Час отримання результату

Одна з найважливіших переваг MALDI-TOF MS - швидкість ідентифікації:

Tаб 1: Порівняння часу ідентифікації мікроорганізмів

MALDI-TOF MS скорочує загальний час отримання мікробіологічного діагнозу приблизно на 24 години, що критично важливо при життєзагрожуючих інфекціях, сепсисі, менінгіті та у випадках повільнорослих мікроорганізмів.

Точність і надійність

Численні дослідження демонструють високу точність MALDI-TOF MS:

• Ідентифікація на рівні виду: 92–98% для рутинних ізолятів

• Конкордантність з 16S rRNA секвенуванням: понад 99% на рівні роду

• Переваги для грамнегативних бактерій: ≥97% точність при прямому нанесенні колонії

• Грампозитивні бактерії та дріжджі: потребують додаткової екстракції (метод з мурашиною кислотою) для досягнення точності 90–95%

Порівняння з біохімічними методами: MALDI-TOF MS демонструє точність, що дорівнює або перевищує традиційні автоматизовані системи (API, VITEK 2, Phoenix), особливо для таких груп мікроорганізмів:

• Анаеробні бактерії

• Група HACEK (Haemophilus, Aggregatibacter, Cardiobacterium, Eikenella, Kingella)

• Коагулазонегативні стафілококи

• Нетуберкульозні мікобактерії (при використанні спеціальних протоколів)

Особливості та переваги MALDI-TOF MS

Пряма ідентифікація з позитивних гемокультур

Одне з найперспективніших застосувань MALDI-TOF MS - швидка ідентифікація мікроорганізмів безпосередньо з позитивних пляшок гемокультури без необхідності субкультивування. Це критично важливо при сепсисі, де кожна година затримки адекватної терапії підвищує летальність.

Ідентифікація безпосередньо з сечі та цереброспінальної рідини

MALDI-TOF MS може використовуватися для прямої ідентифікації мікроорганізмів у рідких біологічних зразках:

Сеча: при концентрації бактерій ≥10⁴–10⁵ КУО/мл можлива пряма ідентифікація з точністю до 91,8% на рівні виду. Метод фільтрації (78,9% правильних ідентифікацій) та короткочасне культивування на твердому середовищі протягом 5 годин (84,2% точність) показують кращі результати порівняно з диференційною центрифугацією (68,4%).

Цереброспінальна рідина (ЦСР): при бактеріальному менінгіті пряма ідентифікація можлива при концентрації ≥10⁶ КУО/мл. Описані випадки успішної швидкої діагностики менінгіту, спричиненого Klebsiella pneumoniae, безпосередньо з ЦСР.

Обмеження MALDI-TOF MS

Незважаючи на численні переваги, метод має певні обмеження:

Таксономічні виклики

1. Близькоспоріднені види: труднощі у диференціації Streptococcus pneumoniae від Streptococcus mitis/oralis, Escherichia coli від Shigella spp., видів комплексу Enterobacter cloacae

2. Мікобактерії: неможливість диференціації видів комплексу Mycobacterium tuberculosis без спеціальних протоколів

3. Міцноспоріднені грампозитивні коки: потребують додаткових тестів (наприклад, тест на розчинність у жовчі для пневмококів)

Технічні обмеження

1. Залежність від бази даних: ідентифікація можлива лише для мікроорганізмів, представлених у референсній базі. Рідкісні або нові види можуть не ідентифікуватися. Проте база даних постійно оновлюється.

2. Полімікробні інфекції: складність у виявленні та ідентифікації усіх видів при змішаних інфекціях. Дослідження анаеробної бактеріємії показало, що MALDI-TOF MS не виявила деякі види у 13% випадків полімікробних інфекцій

3. Концентрація мікроорганізмів: для прямої ідентифікації з клінічних зразків необхідна мінімальна концентрація 10⁴–10⁶ КУО/мл

Організми, що потребують спеціальних протоколів

1. Нитчасті гриби та дерматофіти

2. Інкапсульовані штами (Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae)

3. Nocardia species (потребують силікатних кульок для руйнування клітинної стінки)

4. Слизисті бактерії

Автоматизація процесу

Розробляються роботизовані системи автоматичного відбору колоній (наприклад, MALDI Colonyst robot), що значно підвищує ідентифікаційний score порівняно з ручним нанесенням та дозволяє повністю автоматизувати процес від первинного посіву до результату ідентифікації.

Рідинна хроматографія-мас-спектрометрія (LC-MS/MS) у мікробіології

Окрім MALDI-TOF MS, у клінічній мікробіології зростає інтерес до застосування рідинної хроматографії з тандемною мас-спектрометрією (LC-MS/MS). Цей метод традиційно використовується для кількісного аналізу низькомолекулярних сполук у токсикології та терапевтичному лікарському моніторингу, але наукова література щодо ідентифікації бактерій за допомогою LC-MS/MS поступово розширюється. Описані методи одночасної ідентифікації стафілококів та детекції антибіотикорезистентності, хоча вони ще перебувають у стадії розробки.

Клінічний вплив

Впровадження MALDI-TOF MS у клінічну практику призводить до:

• Скорочення часу призначення цільової антибіотикотерапії

• Зменшення використання антибіотиків широкого спектру

• Покращення прогнозу пацієнтів з тяжкими інфекціями

• Зменшення тривалості госпіталізації

• Зниження витрат на лікування

Висновки

MALDI-TOF мас-спектрометрія здійснила фундаментальний зсув у рутинній практиці клінічної мікробіології, ставши незамінним інструментом сучасної діагностичної лабораторії. Метод поєднує швидкість (результат за хвилини), високу точність (92–98% ідентифікація на рівні виду), економічну ефективність  та універсальність застосування (бактерії, гриби, мікобактерії, пряма ідентифікація з гемокультур та інших біологічних рідин).

Незважаючи на певні обмеження у диференціації близькоспоріднених видів та залежність від повноти референсної бази даних, переваги MALDI-TOF MS значно переважають недоліки. Розвиток методу йде у напрямку детекції антибіотикорезистентності, мікробного типування, комбінації з іншими технологіями та повної автоматизації процесу.

Для українських лабораторій впровадження MALDI-TOF MS є стратегічно важливим кроком до підвищення якості мікробіологічної діагностики, покращення результатів лікування інфекційних захворювань та оптимізації використання антимікробних препаратів у контексті зростаючої проблеми антибіотикорезистентності.

Список літератури

1. Calderaro, A., & Chezzi, C. (2024). MALDI-TOF MS: A reliable tool in the real life of the clinical microbiology laboratory. Microorganisms, 12(2), 322. https://doi.org/10.3390/microorganisms12020322

2. Tsuchida, S., Umemura, H., & Nakayama, T. (2020). Current status of matrix-assisted laser desorption/ionization–time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) in clinical diagnostic microbiology. Molecules, 25(20), 4775. https://doi.org/10.3390/molecules25204775

3. Nomura, F., Tsuchida, S., Murata, S., et al. (2020). Mass spectrometry-based microbiological testing for blood stream infection. Clinical Proteomics, 17, 14. https://doi.org/10.1186/s12014-020-09278-7

4. Lasch, P., et al. (2025). A MALDI-ToF mass spectrometry database for identification of highly pathogenic bacteria. Scientific Data, 12, 145. https://doi.org/10.1038/s41597-025-04504-z

5. ASM Journals. (2025). Limitations of MALDI-TOF MS in identifying anaerobic bacteremia: challenges in polymicrobial infections and the role of whole-genome sequencing. Microbiology Spectrum. https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.01014-25

6. Josten, M., Dischinger, J., Szekat, C., et al. (2014). Identification of agr-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring the class A mec complex by MALDI-TOF mass spectrometry. International Journal of Medical Microbiology, 304(8), 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

7.  ASM Journals. (2025). Novel, rapid, and reliable typing of vancomycin-resistant Enterococcus faecium CC17/ST80 strains using MALDI-TOF MS. Microbiology Spectrum. https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02702-25 

8. Frontiers. (2025). Application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry in the detection of vancomycin-resistant and -susceptible Enterococcus faecium. Frontiers in Microbiology. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2025.1603986/full