MALDI-TOF масс-спектрометрия: революционный метод идентификации микроорганизмов

MALDI-TOF масс-спектрометрия: революционный метод идентификации микроорганизмов в клинической микробиологии

Введение

Масс-спектрометрия с матрично -активированной лазерной десорбцией/ионизацией и времяпролетным анализатором ( Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) за последнее десятилетие совершила революцию в клинической микробиологии, изменив подход к идентификации патогенных микроорганизмов. Эта технология стала стандартом в ведущих лабораториях мира благодаря скорости, точности и экономической эффективности по сравнению с традиционными биохимическими методами.

Принцип работы MALDI-TOF масс-спектрометрии

Основы метода

MALDI-TOF MS базируется на протеомном анализе конститутивных белковых профилей микроорганизмов, преимущественно высокоэкспрессированных. рибосомальных белков. Процесс идентификации включает следующие этапы:

1. Подготовка образца: небольшое количество микробной биомассы (достаточно 10²–10⁴ клеток) наносится на металлическую мишень-пластину и смешивается с матрицей (чаще всего α-циано-4-гидроксикорической кислотой, CHCA).

2. Ионизация: короткие лазерные импульсы вызывают десорбцию и ионизацию белковых молекул. Матрица защищает эталон от фрагментации во время ионизации.

3. Детекция : ионизированные молекулы ускоряются электромагнитным полем (~20 кВ) в вакуумной камере. Время полета ( Time of Flight ) каждой молекулы к детектору зависит от соотношения массы к заряду (m/z).

4. Идентификация: полученный масс-спектр автоматически сравнивается с эталонной базой данных, содержащей более 2000 видов медицинских микроорганизмов. Программное обеспечение генерирует числовое значение ( score ), отображающее степень сходства.

Сравнение MALDI-TOF с традиционным бактериологическим посевом

Время получения результата

Одно из важнейших преимуществ MALDI-TOF MS – скорость идентификации:

Tаб 1: Сравнение времени идентификации микроорганизмов

MALDI-TOF MS сокращает общее время получения микробиологического диагноза примерно на 24 часа, что критически важно при жизнеугрожающих инфекциях, сепсисе, менингите и при медленнорастущих микроорганизмах.

Точность и надежность

Многочисленные исследования демонстрируют высокую точность MALDI-TOF MS:

• Идентификация на уровне вида: 92-98% для рутинных изолятов

• Конкордантность с 16S rRNA секвенированием : более 99% на уровне рода

• Преимущества для грамотрицательных бактерий: ≥97% точность при прямом нанесении колонии

• Грамположительные бактерии и дрожжи: требуют дополнительной экстракции (метод с муравьиной кислотой) для достижения точности 90–95%

Сравнение с биохимическими методами: MALDI-TOF MS демонстрирует точность, равную или превышающую традиционные автоматизированные системы (API, VITEK 2, Phoenix ), особенно для таких групп микроорганизмов:

• Анаэробные бактерии

• Группа HACEK ( Haemophilus , Aggregatibacter , Cardiobacterium , Eikenella , Kingella )

• Коагулазонегативные стафилококки

• Нетуберкулезные микобактерии (при использовании специальных протоколов)

Особенности и преимущества MALDI-TOF MS

Прямая идентификация по положительным гемокультурам

Одно из наиболее перспективных применений MALDI-TOF MS – быстрая идентификация микроорганизмов непосредственно из положительных бутылок гемокультуры без необходимости субкультивирования . Это критически важно при сепсисе, где каждый час задержки адекватной терапии повышает летальность.

Идентификация непосредственно из мочи и цереброспинальной жидкости

MALDI-TOF MS может использоваться для прямой идентификации микроорганизмов в жидких биологических образцах:

Моча: при концентрации бактерий ≥10⁴–10⁵ КОЕ/мл возможна прямая идентификация с точностью до 91,8% на уровне вида. Метод фильтрации (78,9% правильных идентификаций) и кратковременное культивирование на твердой среде в течение 5 часов (84,2% точность) показывают лучшие результаты по сравнению с дифференциальной центрифугацией (68,4%).

Цереброспинальная жидкость (ЦСР): при бактериальном менингите прямая идентификация возможна при концентрации ≥10⁶ КОЕ/мл. Описаны случаи успешной быстрой диагностики менингита, вызванного Klebsiella pneumoniae , непосредственно с ЦСР.

Ограничение MALDI-TOF MS

Несмотря на многочисленные преимущества, метод имеет определенные ограничения:

Таксономические вызовы

1. Близкородственные виды: трудности в дифференциации Streptococcus pneumoniae от Streptococcus mitis / oralis , Escherichia coli от Shigella spp ., видов комплекса Enterobacter cloacae

2. Микобактерии: невозможность дифференциации видов комплекса Mycobacterium tuberculosis без специальных протоколов

3. Прочнородственные грамположительные коки: требуют дополнительных тестов (например, тест на растворимость в желчи для пневмококков)

Технические ограничения

1. Зависимость базы данных: идентификация возможна только для микроорганизмов, представленных в референсной базе. Редкие или новые виды могут не идентифицироваться. Однако база данных постоянно обновляется.

2. Полимикробные инфекции: сложность в выявлении и идентификации всех видов при смешанных инфекциях. Исследование анаэробной бактериемии показало, что MALDI-TOF MS не выявила некоторые виды в 13% случаев полимикробных инфекций.

3. Концентрация микроорганизмов: для прямой идентификации по клиническим образцам необходима минимальная концентрация 10⁴–10⁶ КОЕ/мл

Организмы, требующие специальных протоколов

1. Нитчатые грибы и дерматофиты

2. Инкапсулированные штаммы ( Klebsiella pneumoniae , Haemophilus influenzae )

3. Nocardia species (требуют силикатных шариков для разрушения клеточной стенки)

4. Слизистые бактерии

Автоматизация процесса

Разрабатываются роботизированные системы автоматического отбора колоний (например, MALDI Colonyst robot ), что значительно повышает идентификационный score по сравнению с ручным нанесением и позволяет полностью автоматизировать процесс от первоначального посева до результата идентификации.

Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (LC-MS/MS) в микробиологии

Кроме MALDI-TOF MS, в клинической микробиологии растет интерес к применению жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS). Этот метод традиционно используется для количественного анализа низкомолекулярных соединений в токсикологии и терапевтическом врачебном мониторинге, но научная литература по идентификации бактерий с помощью LC-MS/MS постепенно расширяется. Описаны методы одновременной идентификации стафилококков и детекции антибиотикорезистентности , хотя они еще находятся в стадии разработки.

Клиническое воздействие

Внедрение MALDI-TOF MS в клиническую практику приводит к:

• Сокращение времени назначения целевой антибиотикотерапии

• Уменьшение использования антибиотиков широкого спектра

• Улучшение прогноза пациентов с тяжелыми инфекциями

• Уменьшение продолжительности госпитализации

• Снижение затрат на лечение

Выводы

MALDI-TOF масс-спектрометрия осуществила фундаментальное смещение в рутинной практике клинической микробиологии, став незаменимым инструментом современной диагностической лаборатории. Метод сочетает скорость (результат в минуты), высокую точность (92–98% идентификация на уровне вида), экономическую эффективность и универсальность применения (бактерии, грибы, микобактерии, прямая идентификация из гемокультур и других биологических жидкостей).

Несмотря на определенные ограничения в дифференциации близкородственных видов и зависимости от полноты референсной базы данных, преимущества MALDI-TOF MS значительно преобладают недостатки. Развитие метода идет в направлении детекции антибиотикорезистентности , микробного типирования , комбинации с другими технологиями и полной автоматизации процесса.

Для украинских лабораторий внедрение MALDI-TOF MS является стратегически важным шагом к повышению качества микробиологической диагностики, улучшению результатов лечения инфекционных заболеваний и оптимизации использования антимикробных препаратов в контексте растущей проблемы антибиотикорезистентности .

Список литературы

1. Calderaro , A., & Chezzi , C. (2024). MALDI-TOF MS: A reliable tool in the real life of the клиника microbiology laboratory . Microorganisms , 12(2), 322. https://doi.org/10.3390/microorganisms12020322

2. Tsuchida , S., Umemura , H., & Nakayama , T. (2020). Current status of matrix-assisted laser desorption / ionization – time-of-flight mass спектрометрия (MALDI-TOF MS) in клиника diagnostic microbiology . Molecules , 25(20), 4775. https://doi.org/10.3390/molecules25204775

3. Nomura , F., Tsuchida , S., Murata , S., et al . (2020). Mass spectrometry-based microbiological testing for blood stream infection . Clinical Proteomics , 17, 14. https://doi.org/10.1186/s12014-020-09278-7

4. Lasch , P., et al . (2025). A MALDI- TOF mass spectrometry database for identification of highly pathogenic bacteria . Scientific Data , 12, 145. https://doi.org/10.1038/s41597-025-04504-z

5. ASM Journals . (2025). Limitations of MALDI-TOF MS in identifying anaerobic bacteremia : challenges in polymicrobial infections and the role of whole-genome sequencing . Microbiology Spectrum . https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.01014-25

6. Josten , M., Dischinger , J., Szekat , C., et al . (2014). Identification of agr-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus harbouring the class A mec complex by MALDI-TOF mass spectrometry . International Journal of Medical Microbiology , 304(8), 1018-1023. https://doi.org/10.1016/j.ijmm.2014.07.005

7.  ASM Journals . (2025). Novel , rapid , and reliable typing of vancomycin-resistant Enterococcus faecium CC17/ST80 strains с помощью MALDI-TOF MS. Microbiology Spectrum . https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.02702-25 

8. Frontiers . (2025). Application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry in the detection of vancomycin-resistant and - susceptible Enterococcus faecium . Frontiers in Microbiology . https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2025.1603986/full